细胞冻存的步骤有哪些？

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。

下面咱们来了解细胞冻存的步骤有哪些吧！

(一)细胞冻存

1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液;

2、取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3、去除PBS，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;

4、离心1000rpm，5min;

5、去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml;

6、将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml;

7、在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;

8、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

(二) 细胞复苏

1、从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2、从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀;

3、离心， 1000rpm，5min;4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养;5. 次日更换一次培养液，继续培养。