新手RNA提取需要注意什么?

2023-09-13

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在进行基因表达量分析或是构建cDNA文库时,需要从组织或者细胞中进行RNA提取,获得纯度高、完整性好的RNA,对后续的实验至关重要。不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白质、DNA等杂质,最终获得高纯度RNA产物的过程,Trizol法是最为常见也是最经典的提取方法。RNA提取过程中,有哪些是值得注意的?

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1、Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol试剂含有苯酚,具有毒性和刺激性,操作过程中注意做好防护措施,不要滴到皮肤上。2、 RNA提取过程中RNase污染的主要来源是手、唾沫和空气中的浮沉,注重配带手套和口罩,样品尽可能盖严。3、细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低RNA的得率,因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质(结缔组织和骨除外)。4、在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作,防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。5、RNA提取过程中所使用的塑料制品、玻璃和金属物品的处理。尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常不必再处理。玻璃及金属物品,使用前进行DEPC泡制处理,而后进行高压灭菌处理。6、处理存在细胞壁特别结构的酵母和一些细菌时,可以在加入Trizol试剂的同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡,使细胞裂解充分。7、由于RNase无处不在,导致RNA降解,因此可以根据后续实验设计,进行RNA处理,一般RNA提取后随即进行反转录反应。