友康生物
2025-11-13
行业热点NK细胞培养，是免疫学研究与相关疗法开发中的关键一环。然而，高效、高活性的NK细胞获取并非易事，其中充满了各种细节与挑战。您是否也曾为细胞存活率、扩增效率或杀伤活性而困扰？本系列文章将直击核心，为您分享那些不容忽视的关键技巧与实战Tips，助您显著提升培养效率，让您的NK细胞培养事半功倍！
Q:不同血液样本如何采集？
采集脐血需使用枸橼酸钠抗凝的采血袋，采集外周血应使用肝素钠抗凝的采血管，避免使用EDTA抗凝的采血管。
肝素钠/肝素锂抗凝采血管为绿色管盖，区别于无抗凝的红色和EDTA抗凝的紫色。
原理：NK细胞的激活往往依赖于钙离子介导的信号转导过程。EDTA（乙二胺四乙酸）作为一种常用的络合剂，能与金属离子（如钙离子Ca²⁺）发生螯合作用。这种螯合作用会抑制细胞的增殖。
Q:使用采血袋采集样本时应注意什么？
若使用采血袋采集血样，建议使用100mL容量的采血袋。如果采血时用200mL采血袋，建议取出14mL抗凝剂。根据血样采集量，抗凝剂占比可能在10%-40%，抗凝剂占比低于30%时，使用自体血浆进行培养；抗凝剂占比高于30%时，血浆中的抗凝剂会抑制细胞生长，此时建议使用商品化的人AB血清替代自体血浆。
Q:样本采集之后要注意什么？
样本应4℃保存，2h内送至实验室分离样本，样本保存时间不应超过8h。
采血后应尽快进行实验，间隔时间不宜过长，运输应在4℃进行，避免血样结冰。
原理：血液离体之后，由于缺乏体内的营养供应和代谢支持，细胞活性逐渐降低、形态逐渐改变，长时间的运输也会导致溶血，因此应尽量避免血样的长途运输。
Q:NK试剂套装该如何选择？
应根据血样本身的情况以及想要达到的培养效果，选择合适的试剂盒。
标准系列NK培养套装可适配绝大多数正常来源的脐血、外周血，包括冻存细胞，能取得一个比较稳定的培养结果。
超纯和高纯NK培养套装可针对老年患者、严重基础疾病、癌症患者、有长途运输过程的血样，能保障这种特殊样本也能获得很高的细胞数量和阳性率，尤其是超纯系列套装可将细胞纯度提升至逼近99%，极其适用于临床应用和细胞药物申报工作。
具体的选择攻略，可参考：NK细胞培养总失败？友康NK培养套装选择攻略，帮您轻松匹配需求！
Q:在分离单个核细胞时，应注意什么?
①预温：分离单个核细胞前，应将血液及各试剂预温至20℃，并在室温下进行离心。
②时间限制：血液采集后应在8小时内分离单个核细胞。
③稀释比例：
外周血：用生理盐水按1:1的比例稀释.
脐带血：用生理盐水按1:2的比例稀释。
④离心条件：
应注意血浆提取和单个核细胞分离时离心力和时间的设置，具体参数可参考友康的NK培养说明书。
离心机选择支持调节升降速的设备。
原理：过快的减速度（即离心机降速过快）可能导致离心完的样品出现回混现象，会使已经分层的细胞再次混合，导致分离失败。缓慢的升降速有助于在离心过程中保持样品各层的清晰界面，减少细胞间的相互干扰和混合，从而提高PBMC的分离纯度。
因此必须使用可以调节升降速的离心机，并提前确认离心机实际降速档位的快慢。
⑤操作细节：
在分离过程中，注意不要将稀释血液混入淋巴细胞分离液中，保持明显的分层。
吸取单个核细胞（白膜层）时要轻柔，避免破坏细胞结构。要尽可能收集完全，可上下多吸一小部分，否则可能导致单个核细胞收集率不高，接种数不够。
⑥脐带血红细胞处理：脐带血单个核细胞计数前应使用红细胞裂解液裂解红细胞。
Q:使用培养瓶时应注意什么？
应选择TC处理的培养瓶。友康生物50mL版本使用T75初始接种，30mL版本使用2个T25初始接种，初始包被液浓度根据培养瓶底面积进行设计，一定要备好对应版本的培养瓶，使用过大或过小的底面积会导致细胞收到的刺激不足或者过量，影响最终实验结果。
原理：TC全称为Tissue Culture Treated，即组织培养处理。TC处理表示该细胞培养瓶经过表面的改性处理，以增强其适合贴壁细胞生长的能力，有助于抗体的稳定结合，减少抗体的脱落和失活。因此NK培养必须从一个TC处理的培养瓶开始，D3之后刺激阶段结束，可使用非TC处理的培养瓶。
Q:淋巴细胞分离液该如何选择？
NK细胞的纯因子培养工艺是将单个核细胞诱导扩增为NK细胞，因此在诱导扩增NK细胞前，需将血液中的单个核细胞分离出来，而分离的步骤就需要用到淋巴细胞分离液。
淋巴细胞分离液必须选择人淋巴细胞分离液，其密度必须为1.077g/mL。
小鼠淋巴细胞分离液密度约为1.081g/mL。
原理：淋巴细胞分离液是一种基于密度梯度离心原理的即用型分离液，主要用于从人外周血、脐带血、骨髓等样本中分离淋巴细胞。它通过利用不同细胞在密度梯度离心中的沉降差异，将淋巴细胞与其他细胞分离开来。单个核细胞的密度小于1.077 g/mL，所以将稀释后的血样加入淋巴细胞分离液，经过离心后，比1.077密度大的细胞可以穿过Ficoll层并到达管底，而比1.077密度小的PBMC经过离心后不能穿过Ficoll层，因此停留在样品层和Ficoll分离液的交界处，即白膜层。
Q:如何使用红细胞裂解液？
因脐血单个核细胞中易掺入红细胞，计数结果常出现大的误差，这会导致接种密度出现偏差，应使用红细胞裂解液将红细胞裂解后再计数。
红细胞裂解液的使用方法：
一份脐带血提取所得的单个核细胞，用5mL培养基重悬。①20μL单个核细胞悬液加入200μL DPBS（11x稀释）；②取单个核细胞11x稀释液100μL加入200μL红细胞裂解液，此时为33x稀释；③室温孵育5~ 15分钟后计数，孵育时间不可超过15分钟33x稀释后密度在1E6/mL以下，可以确保红细胞裂解完全，若密度在1E6/mL以上，建议将单个核细胞悬液进一步稀释后再加红细胞裂解液。
Q:NK细胞接种密度是多少？
外周血单个核细胞推荐接种密度为2E6/mL，新鲜脐带血单个核细胞推荐接种密度为 3E6/mL，冻存脐带血单个核细胞推荐接种密度为 3.5E6/mL，接种密度过低或过高对最终收获的细胞数和NK纯度都会有影响。
若采用超小规模培养体系（即5mL小体积血样、终体积1L），外周血单个核细胞推荐接种密度为2E6/mL，接种4mL/孔，脐带血单个核细胞推荐接种密度为4E6/mL，接种2mL/孔。
Q:小体积血样分离PBMC的注意事项有哪些？
为确保5mL小体积血样收获足够的单个核细胞，吸取白膜层后，第一次清洗时加大稀释比例，可以提高单个核细胞收获率，具体操作如下：
轻轻吸取单个核细胞（白膜层）并转移至新的 15mL离心管内，按照1:2.5的比例加入生理盐水清洗细胞（如2mL白膜层，需要5mL生理盐水），室温700g离心10min。弃上清，再次用总体积相同的生理盐水清洗细胞（如第一次清洗时白膜层与生理盐水总体积7mL，则第二次清洗时需要用7mL生理盐水），200g离心10min，弃上清。用1mL 预温至37℃的培养基重悬细胞，备用，同时取少量细胞悬液计数。(离心机升速均调节至9，降速9)
Q:对于质量不佳的血样怎么提升培养成功率？
脐带血作为NK细胞的重要来源，但其质量参差不齐。脐带血的采集时间受产妇生产过程影响，难以精确控制时间、样本量等因素，导致样本质量波动较大。长途运输过程中的温度变化、运输时间过长（超过8小时）、冷冻保存、抗凝剂比例过高等因素，都会进一步降低细胞活性。
此外，采集的外周血样本中，比如肿瘤患者、老年人等来源的样本中，其单个核细胞可能受损，影响最终的培养过程。
可以从以下2个方面提升培养成功率：
①选择超纯NK培养套装：套装中的核心产品“免疫细胞修复培养基2.0（rHSA）”，采用细胞修复与血浆修复因子技术的双重结合，使受损细胞得到修复、增殖能力显著提升，特别适合长途运输的、抗凝剂比例异常或冻存质量不确定的样本，让这些本来得率较低、甚至难以培养成功的样本也能获得一个比较出色的结果。
②采用慢补液程序：慢补液程序，可以为细胞提供充足的增殖时间，培养结果更稳定，成功率更高，18天左右收获细胞。适用于质量较差的样本，比如冻存效果不佳的单个核细胞，保存时长8h以上的血样，抗凝剂比例20%以上的脐带血。（具体补液流程参考友康超纯NK套装说明书）
Q:NK培养中更换容器时的注意事项有哪些？
更换培养容器的条件：
NK细胞培养过程中更换培养容器时（比如一个T175瓶分为2个T175瓶、T175瓶的细胞入袋），NK细胞会在新容器中贴壁、形成一层“滋养层细胞”，如果细胞少且新容器底面积大，会导致大量细胞贴壁、短时间内细胞密度严重降低细胞间无法相互作用，可能会导致培养失败。更换新的培养容器时一定要确保足够细胞数（若补液后两天细胞数不足以分瓶或入袋，则延长培养时间至3天。若间隔3天细胞数仍不足，可以在原培养容器小体积补液再培养2~3天。每次补液可以维持细胞生长3天，不可延迟到第4天补液），并根据要求折叠培养袋。
NK细胞转袋时需要注意以下事项：
一、培养基预温：
（1）每次补液用的培养基需预温至37℃，用多少取多少，禁止将整瓶培养基反复预温。
（2）尚未添加因子的培养基，可以在37℃水浴锅预温1h不影响其性能。
（3）已经添加因子的培养基，37℃条件下长时间预温可能会导致因子失效，因此使用水浴锅预温培养基时，根据培养基体积不同，需严格限定预温时间，具体操作如下:
①将水浴锅打开，温度上升至 37℃。
②取所需培养基加入预温容器，置于水浴锅中预温，预温时长参考下表。
| 补液体积 | 预温容器 | 预温时长 |
| 5~10 mL | 15 mL离心管 | 5 分钟 |
| 20 mL | 50 mL离心管 | 10 分钟 |
| 30 mL | 50 mL离心管 | 15 分钟 |
| 50 mL | 50 mL离心管 | 25 分钟 |
| 200 mL | 250 mL离心管 | 30 分钟 |
| 500 mL | 500 mL离心管 | 30 分钟 |
| 1 L | 培养基原瓶 | 30~45 分钟 |
预温时长下限:用手触摸培养基，培养基温度不低于手指温度。(避免温度太低导致细胞应激)
预温时长上限:培养基温度达到 37℃后再持续预温30min。(避免长时间预温导致因子失效)
③ 预温时间到，将培养基取出，预温容器外表面擦干水分、喷75%酒精，开始补液。
二、贴壁细胞处理：
T175瓶转袋时，预留一些培养基润洗贴壁细胞，建议洗两次，尽可能一次性转入袋中。如果细胞贴壁较为牢固，可采取培养瓶中贴壁细胞和袋中悬浮细胞分开培养的方式，在下一次补液时贴壁细胞会逐渐松散，再转入袋中。
或者可以在瓶中加入15mL PBS，室温静置10分钟，贴壁细胞就会自行脱落，再进行回收。
三、培养袋折叠：
转袋时，是从较小体积转到较大体积，注意要将培养袋对折一下，使用合适的表面积，防止培养表面积扩大后导致的细胞增殖缓慢甚至停滞。
四、避免扰动细胞：
转袋后只需要正常观察预温补液就好，不要摇晃、敲打培养袋排空气，防止破坏细胞团。
五、细胞收集：
在转袋过程中，要确保尽可能转移所有细胞入袋，特别是注意收集贴壁细胞，以保证细胞数量和质量。
这些注意事项有助于确保NK细胞在转袋过程中的顺利过渡和后续的健康增殖。
Q：NK培养过程中如何正确计数？
由于NK细胞结团生长的特性，计数时应轻微吹散细胞后才准确。使用友康NK培养试剂若正确把控初始细胞的条件，无需计数补液按照推荐流程操作即可。
