友康生物
2023-04-14
公司热点4月7日-8日，友康生物受邀参加了中国医药生物技术协会主办的干细胞临床研究研讨会。在大会中友康的细胞类产品吸引了众多行业专家、客户以及行业同仁们的目光。基于嘉宾们的热烈反馈，友康在此基础上于4月11日举办了产品卫星宣讲会，更深层次解答了大家的疑问。会议内容干货满满，以下整理会议精粹，以飨读者！
直播概述
一、GMP级MSC无血清培养体系介绍
GMP级间充质干细胞无血清培养基
产品优势：
√成分明确：蛋白种类不超过20种，总含量低于1.5mg/mL，全部为人工重组体系，无人源无动物源。
√连续传代：无需更换培养基即可实现原代分离及高代次传代。
√工业级培养：改善细胞贴壁性能，适合细胞产品的大规模生产及3D培养体系。
GMP级玻璃化细胞冻存液
产品优势：
√成分明确：无蛋白，无血清，无动物源成分，所有成分明确。
√通用性：无DMSO，无细胞毒性物质，安全性高。
√简易性：无需程序降温，可直接投入-80°C，12h后，即可置于液氮中长期冻存。
√成本低：可以常温运输及保存，运输成本大大降低。
二、MSC的原代分离及连续传代工艺要点
◆供者筛选
1、伦理审核。
2、新生儿父母的遗传病史、传染病史、健康状况。
3、知情同意书。
4、血检HBV、HCV、HIV、TP。
◆脐带组织的运送
1、脐带运送液：脐带运送过程中应4°C运输，保存在液体环境中，不可干燥放置。
2、短距离运送（＜6h）可使用DPBS或生理盐水加双抗。
3、长距离运送（6-24h）建议使用完全培养基加双抗。
4、脐带进入实验室后若不处理，应立刻放入4°C条件保存。
◆高效分离脐带原代MSC
1. 将医用剪刀、组织、手术柄、手术刀等器械提前灭菌。
2. 用含25mg/L庆大霉素的DPBS清洗脐带3遍，然后用不含庆大霉素的DPBS清洗脐带至清洗液无血色。
3. 使用剪刀将脐带处理成2cm大小的组织段，每段组织沿带静脉将脐带剪开。
4. 使用组织镊撕去脐带静脉内膜、外皮、两根动脉使华通氏胶充分暴露。
5. 使用手术刀将华通氏胶剪切成边长3-5mm 的小块，每2cm组织段切成的华通氏胶小块接种于一个150mm培养血中，使组织块均匀分布，添加10mL-15mL完全培养基。
6. 24-48h 后，补充完全培养基至30mL。
7. 7天全量换液。
8. 10 天全量换液。
9. 12-14 天收获原代细胞。
◆MSC的连续传代
1. 在显微镜下观察培养的MSC细胞 ，当细胞融合度达到80~90%，即可传代。
2. 在超净台中，收集培养瓶中的培养液，加入10mL DPBS清洗细胞后弃去。
3. 加入适量干细胞温和消化酶常温下消化细胞。
4. 在显微镜下观察到细胞全部收缩变圆，且有少量细胞开始流动时（一般2-5分钟），立即加入温和酶使用
量2倍体积的细胞培养上清或者DPBS稀释细胞悬液。
5. 用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。
6. 将细胞悬液转移到离心管中，300g离心5 min。弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，使用台盼蓝染色，
或流式细胞仪等方法计数。
7. 按密度8000cells/cm2 （原代培养基）或10000 cells/cm2（GMP级培养基）重新接种细胞。
8. 将培养瓶置于37℃，5%CO2 ，饱和湿度条件下培养。
三、全新CIK产品性能介绍
全新CIK细胞无血清培养套装
产品优势：
√稳定性：培养14天可获得200倍以上细胞扩增，CD3+ CD56+比例达到30%以上。
√通用性：外周血和脐血来源的CIK均可培养，新鲜样本与冻存样本均可培养，仅需20~30mL血样即可上样培养。
√程序化：培养方式简单易行，细胞状态基本统一，按照推荐流程补液，无需进行细胞计数。
四、免疫细胞培养核心要点
1、为了避免抗凝剂占比过高影响自体血浆的使用，应使脐血中的抗凝剂占比低于30%。
2、每次补液时添加的培养基需预温，用多少取多少，禁止将整瓶培养基预温、禁止反复预温。
3、刚入袋时，一般细胞培养袋大而细胞液体积小，建议将培养袋对折使用，选择合适的底面积培养。
4、培养前期一定不要吹打细胞团（D0-D5），以减少细胞机械损伤。
答疑环节
1、Q:培养间充质干细胞时是否可以用酶解法处理脐带？
A:可以用酶解法处理，但是酶的浓度和消化时间控制不好可能会损伤细胞膜，降低细胞活性，并且操作较植块法更繁琐，增加污染的机会，所以还是建议用植块法。
2、Q:培养间充质干细胞冻存样本和新鲜样本的操作区别是什么？
A:培养冻存样本，其细胞活力和细胞数肯定会受到影响，所以相较于新鲜样本，我们建议提高接种密度。
3、Q:分离单个核细胞时，红细胞掺杂比较多，怎么改善？
A:一般脐血中会存在红细胞掺杂比较多的问题，红细胞会在5～7天时皱缩凋亡，但是它会影响单个核细胞的计数。一般有两个处理方案：1、对脐血下层红色液体，按照1:2的比例采用缓冲液进行稀释；2、取少部分细胞悬液，做红细胞裂解，从而达到对单个核细胞精确计数的目的。
4、Q:补液的时候不计数，如果细胞扩增数量很低，补液过多会对细胞生长有影响吗？
A:友康的补液方案适用于大多数培养方案，最大程度也仅是1:2补液，有些经验非常老道的用户甚至可以做到1:3或1:4的补液。按照我们的培养体系，几乎没出现过扩增倍数非常低的情况。
5、Q:免疫细胞成团分布，如果不吹打细胞团，会引起细胞老化吗？
A:免疫细胞成团分布是一种非常正常的细胞形态，不吹打不会引起细胞老化。如果细胞团过大，可以在镜下观察，如果细胞团内部呈现一种透亮的状态，说明团块内部营养物质很充足。如果团块呈现出漆黑的状态，此时可以适当考虑把细胞团块吹散。
6、Q:分离单个核细胞白膜层时，升降速度对收集细胞的影响有什么影响？
A:离心机影响细胞收集的因素主要是升降速的稳定性，降速不稳会导致白膜层分离不出来。NK细胞收获时，建议设置为700g 30min，升6降4，国产离心机升1降1。
7、Q:hUC-MSC消化时成片脱落是什么原因？胰蛋白酶0.05%和0.25%推荐哪个浓度？
A:一般有两个原因会引起MSC消化时成片脱落：1.细胞密度太大，消化酶无法渗入细胞与细胞之间的细胞间质中；2、消化酶的消化效力太快。如果使用胰蛋白酶，推荐0.25%的浓度，如果采用无血清体系培养，不建议使用胰蛋白酶，因为这会引入动物源成分。
8、Q:PBMC里的NK冻存复苏后为还能继续扩增吗？
A:免疫类细胞的复苏静默期较长，一次冻存对于细胞质量的影响非常大。培养完成的NK量非常大，经过冻存后较难恢复到新鲜效果，成体NK细胞一般是直接用于临床。
以上就是本次产品卫星宣讲会的精华内容了，您还有其他问题，可以在我们的官网后台留言，我们会第一时间为您解答！
