EP 2.6.7新规下，支原体检测如何快速合规？

在细胞治疗产品、干细胞产品、细胞库放行等场景中，支原体检测是质量控制的关键环节。然而，传统培养法需28天，无法满足自体CAR-T、NK等新鲜回输产品的放行时效；部分支原体生长缓慢甚至不生长，存在假阴性风险。指示细胞培养法操作复杂，同样需要14~28天。行业亟需一种快速、灵敏、标准化的新型检测方案——核酸扩增技术（NAT，如qPCR）。

202年4月1日，欧洲药典EP 2.6.7 (12.2版)正式生效，首次将NAT提升至与培养法、指示细胞培养法同等的核心检测方法地位。虽然EP主要适用于欧盟市场，但其修订思路——强化NAT方法地位、明确灵敏度标准、规范验证要求——对国内支原体检测实践具有重要的参考和指导意义。

变化一：NAT法独立放行

经充分验证后，NAT可作为等效替代方法单独使用，无需并行传统方法。旧版中NAT仅为“替代备选”，新版则并列三大方法，确立了支原体检测的双轨制框架。这一变化直接回应了细胞治疗产品的痛点：传统培养法需28天，而自体CAR-T、NK等产品货架期仅数小时至数天。NAT法3~4小时出结果，同时解决了样本量不足的问题。

 变化二：明确量化灵敏度标准（引入 GC 单位）

新版首次正式引入了基因组拷贝数（Genomic Copies, GC）的概念，为NAT制定了明确的检出限（LOD）硬性指标，若作为传统培养法的等效替代，LOD 必须达到：≤10 CFU/mL或＜100 GC/mL。

为了确保核酸检测结果与传统培养法具有可比性，新版规定用于验证的标准品，须同时测定CFU和GC，且 GC/CFU比值< 10。

 变化三：强制基质抑制验证

必须证明产品基质（细胞上清、培养基、血清、DMSO等）不抑制NAT反应。即使使用的是市售的商业化合规试剂盒，用户须使用自身产品基质完成产品专属验证，包括基质抑制试验、检出限确认、外部阳性对照工作浓度标定、细胞沉淀与上清同时检测、方法转移，以及在工艺或基质发生变更时进行再验证。

 变化四：质控升级—内部质控（IC）、菌株覆盖

内部质控（IC）：强制使用，优先在提取阶段加入（而非仅PCR阶段），以监控核酸释放、纯化到扩增的全流程，避免遗漏提取失败。

菌株覆盖：至少验证EP指定的8种支原体，涵盖可培养和不可培养代表种：口腔、肺炎、猪鼻、发酵、唾液、精氨酸、莱氏无胆甾、人型。同时鼓励增加其他支原体（如生殖支原体、解脲脲原体等）。

国内CDE要求：替代方法须经充分验证

虽然《中国药典》2025年版3301仍以培养法和指示细胞培养法为金标准，但国家药监局药审中心（CDE）发布的两大指导原则已为NAT法打开了通道：

《免疫细胞治疗产品指导原则》（2022年5月）：样品量有限或需要快速放行时，可考虑开发新型检测方法，但须经过充分验证。

《人源干细胞产品指导原则》（2023年4月）：必要时采用快速方法放行应进行方法学验证，并证明检测能力不低于药典法。

在国内申报免疫细胞治疗产品时，qPCR法可作为支原体检测的替代放行方法，但必须按照 《中国药典》9201《药品微生物检验替代方法验证指导原则》 完成全面的方法学验证:定性替代方法用于终产品放行必须验证检出限、专属性、重现性、耐用性四项；用于过程控制至少需验证专属性及检出限。

 友康支原体qPCR检测试剂盒：核心性能满足新规

作为细胞治疗上游领域企业，友康生物基于自身培养基产品开发及客户服务中积累的支原体检测需求，自主研发了支原体qPCR检测试剂盒（货号：MY0001-50）。该试剂盒已参照《中国药典》、EP 2.6.7、JP G3、USP 63、《人源干细胞产品指导原则2023》等国内外权威指南完成性能验证，数据详实，可以帮助您在EP新规和CDE指导原则的双重要求下，快速建立合规的支原体NAT检测方案。 

专属性验证

经序列比对，可覆盖100多种支原体 DNA 序列。已验证可检测常见的11种支原体，但不会检测到进化树上相关的其他物种，如梭菌、乳杆菌和链球菌，与其他常见细菌、真菌以及细胞DNA均无交叉反应。

试剂盒专属性汇总

检出限验证

已验证药典推荐的6种支原体检出限均满足＜10CFU/mL，同时满足GU/CFU小＜10，所以友康支原体检测试剂盒提供了一种高灵敏度的支原体检测方法。

备注：所有支原体检出限验证使用德国Minerva Biolabs（MB）提供的10CFU灵敏度标准品，用友康NK细胞无血清培养基5.0（货号：NC0102）复溶后，稀释到不同浓度，进行提取检测。

与培养法对比灵敏度验证

参照中国药典3301支原体检查法，与培养法对比口腔支原体（ATCC23714）的灵敏度，培养物稀释至10^-3、10^-4、10^-5三个稀释倍数，置于37℃培养28天，培养法的灵敏度达到10^-5，符合中国药典要求。而友康试剂盒可稳定检出10^-5稀释度，灵敏度提高10倍。

产品优势

快速：搭配本公司配套提取试剂盒，最快2个小时获得检测结果。

广谱性强：经序列比对，可覆盖100多种支原体 DNA 序列，已验证可检测常见的11种支原体。

灵敏度高：可稳定检出10CFU/mL的口腔支原体、猪鼻支原体、莱式无胆甾原体、唾液支原体、发酵支原体、精氨酸支原体。

特异性强：可特异性检测常见支原体，与常见细菌、真菌以及人源细胞DNA不存在交叉反应。

可灵活使用：与本公司开发的两款核酸提取试剂盒（货号：MK0103-50、货号：MK0104-50）搭配使用，可用于各种类型的样本检测（细胞悬液、培养液上清、生物制品等）；经验证无干扰的样本，不经样本提取，可以直接检测。

适用场景

主细胞库、工作细胞库、病毒种子批的支原体检定

自体/异体CAR-T、NK、DC等免疫细胞治疗产品的批放行检测

干细胞产品（间充质干细胞、诱导多能干细胞等）的质量控制

生产过程中间品的支原体快速筛查

培养基、生产辅料等物料的入厂检测